Há pesquisas que revelam que práticas que hoje seriam chamadas de homossexualidade e expressões de transgeneridade eram socialmente aceitas entre algumas tribos do território nacional antes da colonização e catequização dos índios. No livro "Devassos no Paraíso", de João Silvério Trevisan, pode-se encontrar evidências na forma de relatos dos próprios portugueses que chegaram ao Brasil, como o do padre Manuel da Nóbrega, que comentou que muitos colonos tinham índios como mulheres, segundo os costumes da terra, em 1549.
Em 1576, o português Pero de Magalhães de Gândavo revelou que os índios Tupinaés se entregavam à sodomia "como se neles não houvera razão de homens". Entre os Tupinambás, há relatos tanto de homossexualidade masculina como feminina e, segundo o "Tratado descritivo do Brasil", de Gabriel Soares de Souza, escrito em 1587, havia entre os indígenas inclusive os que tinham "tenda pública", para aqueles que os quisessem "como mulheres", uma indicação do que hoje chamaríamos de prostituição. Os tibira seriam os índios “gays” e as çacoaimbeguira, as índias “lésbicas”.
As çacoaimbeguira foram descritas como índias extremamente masculinizadas, que exerciam funções usualmente delegadas aos homens, vivendo com uma mulher que as servia como se fossem homens, além de exibirem os tradicionais cortes de cabelo masculinos. Apesar dessa aparente "liberdade sexual", entre os índios tupinambás havia uma cultura de superioridade do homem.
Membros da tribo casavam-se apenas com uma mulher, mas entre os chefes era comum a poligamia, de forma que eles chegavam a esposar até 13 ou 14 mulheres. Nessa sociedade, a mulher era vista como um objeto, de acordo com Hans Staden, e ocorria inclusive de um homem dar sua esposa de presente a outro homem quando se cansasse dela.
Entre os Guaicurus e Xamicos, é possível encontrar relatos sobre os kudína ou cudinhos, homens castrados que passavam a se vestir como mulheres e a executar tarefas femininas, como a tecelagem. Eles também se casavam com outros homens e assumiam o papel sexual das mulheres. Entre os Kadiwéu, o hábito da pintura corporal é reconhecido como uma arte feminina. Os complexos padrões da tribo são pintados pelas mulheres mais velhas e pelos kudína, homens afeminados que incorporavam todos os atributos da mulher e assumiam papéis femininos naquela sociedade.
Segundo o antropólogo Luiz Mott, que dedicou grande parte de sua vida acadêmica a pesquisar relações homoafetivas entre as tribos, em tempos de Inquisição, foi justamente a maior liberdade sexual e a nudez entre índios e escravos, entre outros fatores, que possibilitaram aos sodomitas europeus um espaço privilegiado na colônia para suas práticas homoeróticas.
É importante notar como a diversidade sexual e de gênero já estava presente em múltiplos territórios pelo mundo, o que sugere como o pensamento europeu cristão foi responsável pela imposição de uma moral que não tem relação alguma com "naturalidade". Na medida em que a catequização ocorria no Brasil, essas práticas foram sendo abolidas e condenadas por membros das próprias tribos que aos poucos aprendiam sobre essa ideia construída de "pecado". Portanto, não é tão errado assim afirmar que os primeiros indícios de homofobia podem ter chegado ao Brasil junto com a colonização, em 1500.